La plateforme BIOMADE (BIOhybrid MAterial Design Engineering)

La plateforme BIOMADE (BIOhybrid MAterial Design Engineering), créée dans le cadre de l’action MINATEC-LABS de l’INAC au bâtiment 10.05 (2ème étage, pièce 443), a été mise en route à l’automne 2016. Ce laboratoire, soutenu par le CPER, le programme Nanosciences et le projet Phare A3DN, est rattaché au SyMMES/CREAB. Son activité est dédiée à l’ingénierie des acides nucléiques (ADN,  ARN, analogues structuraux) et leur insertion au sein d’architectures hybrides 2D/3D après conjugaison avec des molécules organiques, des biomolécules, des polymères ou encore des nano- et microparticules.

Vue panoramique du laboratoire BIOMADE

Ce laboratoire regroupe au sein d’un espace unique (cf photo) toutes les techniques nécessaires à cette ingénierie biochimique et chimique depuis la synthèse des fragments d’ADN modifiés, leur fonctionnalisation, leur purification et leur auto-assemblage au sein de nanostructures/nanomatériaux hybrides aux applications potentielles en micro- & nanoélectronique, photonique, plasmonique ou encore dans les technologies pour la santé (biocapteurs, agents d’imagerie, vectorisation). A noter que par son implantation géographique, cette activité bénéficie de la proximité des moyens de nano-caractérisations de la PTA et de la PFNC du campus Minatec.

 

 

APPAREILS DISPONIBLES SUR LA PLATEFORME

 

 

SYNTHETISEURS D’ADN et d'ARN (et analogues structuraux)

 

 

Cycle de synthèse automatisée par la méthode des phosphoramidites en phase solide

 

 

Synthétiser un fragment d’ADN/ARN (oligonucléotide) consiste à relier des nucléosides entre eux  par un groupement phosphate en formant des liens phosphodiesters. Ces nucléosides se composent d’un sucre (désoxyribose pour l’ADN ; ribose pour l’ARN)  et d’une base azotée (A pour Adénine, C pour Cytosine, G pour Guanine, T pour Thymine et U pour Uracile). La chimie de couplage utilisée est celle des phosphoramidites qui permet d’obtenir un rendement de condensation élevé. Cette méthode d’assemblage du bioploymère, qui est réalisée sur support et de manière totalement automatisée (voir photo ci-dessus de 2 synthétiseurs), se déroule en 4 étapes : la détritylation, la condensation, le capping et l’oxydation (cycle de synthèse cf schéma).

 

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE COUPLEE A UN DETECTEUR U.V./VISIBLE, UN DETECTEUR de FLUORESCENCE et UN DETECTEUR DE MASSE

 

 

 

Chromatogramme et spectre de masse d'un fragment d'ADN modifié

 

Photo de la chaîne C.L.H.P. équipée de ses différents détecteurs
Photo de la chaîne C.L.H.P. équipée de ses différents détecteurs

En fin de synthèse, après déprotection et libération du support, les fragments d’ADN sont séparés sur une chaîne de Chromatographie Liquide Haute Performance (C.L.H.P) et identifiés grâce à un détecteur U.V. / Visible (barrette de diodes), un détecteur de fluorescence et à un détecteur de masse de type ESI-MS (source ELECTROSPRAY). Non couplée au détecteur de masse, cette technique est aussi utilisée pour purifier les oligonucléotides issus d’un  mélange brut de synthèse.

 

SPECTROMETRIE DE MASSE MALDI-TOF

 

 

 

Séquençage enzymatique d'un fragment d'ADN modifié

 

 

Le spectromètre de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption ionisation Time of Flight*) est idéal pour l’analyse et la détermination de la masse de molécules de grande taille (isolées ou en mélange) telles que les fragments d’ADN, les protéines, les peptides et polymères. La  source MALDI favorise la formation d’ions possédant une seule charge et le temps de vol se caractérise par une gamme de masse infinie.

 

SPECTROPHOTOMETRE  U.V/VISIBLE

 

 

 

Mesure de température de fusion d'une nanostructure d'ADN

 

 

La spectroscopie U.V./VISIBLE est une méthode utilisée en routine pour doser la quantité d’ADN présente en solution sous forme de simple brin ou double brin. Cette quantification est basée sur l’absorbance du biopolymère dans l’U.V. (maximum d’absorbance à 260 nm). De plus, en chauffant une structure en double brin d’ADN on peut obtenir une séparation de l’édifice en deux simples brins. On parle alors de dénaturation thermique (rupture des liaisons Hydrogène existant entre les bases appariées). La température à laquelle la moitié des molécules d’ADN est dénaturée est appelée température de fusion moléculaire.

L’appareil (Agilent Cary 100, photo ci-dessus)  présent sur la plateforme BIOMADE est équipé d’un double faisceau et d’un passeur d’échantillons multi-cuves thermostaté par effet Peltier avec contrôle de la température qui permet de suivre ce processus de dénaturation et de déterminer ainsi cette température de fusion.

 

SPECTROPHOMETRE U.V. et SPECTROFLUORIMETRE en mode microgoutte

 

 

 

Spectre U.V d'un oligonucléotide modifié

 

 

Ces deux appareils permettent, à l’aide de quelques microlitres seulement, le dosage de solutions d’ADN/ARN par mesure d’absorbance U.V. (Denovix DS-11) ou par fluorescence après marquage par un chromophore (Nanodrop ND3300).

 

 

ELECTROPHORESE (Gel de Polyacrylamide ou d’Agarose)

 

 

 

Séparation de nano-objets à base d'ADN sur gel d'agarose

Système d'electrophorèse sur gel d'acrylamide (à gauche) et imageur de gel associé (à droite)

L’électrophorèse sur gel, en  milieu dénaturant ou non, permet d’analyser les brins d’ADN ou les nano-objets à base d’ADN en fonction de leur taille et de leur charge électrique. Le gel constitué de polymères à base de polyacrylamide ou d’agarose est soumis à une différence de potentiel qui conduit à la séparation des fragments d’ADN /ARN chargés négativement. Cette technique peut être utilisée à l’échelle analytique pour réaliser le contrôle d’un échantillon ou à l’échelle préparative pour faire une purification.Ces gels sont généralement révélés à l’aide d’un intercalant fluorescent (GelRed, SyberGreen, SybrGold…) et numérisés à l’aide d’un imageur de gel (GelDoc BIORAD).

 

 

     L'Equipe CREAB en visite à BIOMADE

 

Contacts :   tél.:84548 ou 866.24

                        tél.:83265 ou 866.24 (page personelle)

 

 

 

Maj : 30/03/2017 (1229)

 

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